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Aug 09, 2023

PCR 분석 설계의 과제와 솔루션

출처: Sebastian Condrea/Getty Images 재현 가능한 PCR 분석을 설계하려면 때로는 미세한 반응량으로 각 구성 요소를 표준화하는 것부터 여러 이동 표적을 최적화하는 것이 포함됩니다.

신용: Sebastian Condrea / 게티 이미지

재현 가능한 PCR 분석을 설계하려면 때로는 미세한 반응량으로 각 구성 요소를 표준화하는 것부터 시약, 샘플 및 PCR 제품의 장기적이고 안전한 보관을 보장하기 위한 사전 계획까지 여러 이동 표적을 최적화해야 합니다.

PCR 기반 진단 테스트의 개발 및 최적화와 관련된 복잡함과 일반적인 과제를 이해하면 연구자가 최신 솔루션을 사용하여 이러한 장애물을 극복하는 데 도움이 될 것입니다. 여기에서는 연구자들이 PCR 기반 분자 진단 분석법을 설계할 때 직면할 수 있는 몇 가지 일반적인 문제와 몇 가지 잠재적인 솔루션에 대해 논의합니다.

PCR 반응을 설계할 때 직면하게 되는 첫 번째 과제 중 하나는 응용 분야에 가장 적합한 중합효소를 선택하는 것입니다. 생물학적 시료의 특성, 증폭할 서열의 길이, 증폭된 제품의 원하는 서열 정확도라는 맥락에서 요구 사항을 평가하는 것이 중요합니다.

PCR 분석 최적화에 대한 광범위한 경험을 갖고 있는 Fortis Life Sciences의 현장 응용 과학자인 Gerald Hunter 박사는 "다양한 DNA 중합효소는 특이성, 효소 기능, 오류율(충실도) 및 PCR 억제제에 대한 내성이 다릅니다."라고 말합니다.

의도한 온도에서 높은 특이성을 갖고 DNA 주형에 어닐링하는 프라이머를 설계하고 반응 혼합물의 구성을 최적화하는 것은 다음 과제를 제기합니다.

Hunter는 "PCR의 성공은 비특이적 프라이머 결합의 낮은 비율을 유지하는 반응 능력에 기초하므로 어닐링 온도가 최적화되어야 하는 중요한 요소가 됩니다"라고 말했습니다. "또한 반응 성능에 영향을 미치는 PCR 완충 성분(pH, 염, Mg2+, 프라이머 및 효소 농도)을 고려해야 하며 최적화가 필요할 수 있습니다."

비특이적 증폭은 일반적으로 프라이머가 설계되지 않은 서열에 결합할 때 발생합니다. 이로 인해 의도하지 않은 제품이 탄생하게 됩니다.

“프라이머 디자인은 예술이자 과학입니다. 올바른 프라이머 농도뿐만 아니라 올바른 프라이머 서열을 갖는 것도 중요합니다.”라고 Hunter는 말합니다. "다행히도 PCR 프라이머 디자인에 사용할 수 있는 무료 온라인 프라이머 디자인 소프트웨어 도구가 많이 있습니다. 하지만 올바른 조합을 찾기 전에 몇 가지 프라이머 쌍 세트를 테스트해야 하는 경우에도 놀라지 마십시오."

비특이적 증폭을 방지하는 한 가지 방법은 PCR 튜브 또는 스트립을 열순환기에 삽입할 준비가 될 때까지 얼음 위에서 반응 혼합물을 준비하는 것입니다. 낮은 온도는 DNA 중합효소의 활성을 감소시켜 프라이머가 부정확하게 결합할 가능성을 감소시킵니다. 이러한 예방 조치에도 불구하고 원하지 않는 제품이 여전히 합성될 수 있습니다.

비특이적 증폭에 대응하는 추가 솔루션은 hot-start DNA 중합효소를 사용하는 것입니다. hot-start DNA 중합효소는 화학적으로 변형되어 실온에서 비활성화되며 비특이적 증폭을 방지합니다. 뉴클레오티드는 열 활성화 단계가 발생한 후에만 변형된 효소에 의해 서로 연결됩니다. 이는 가짜 생성물의 가능성과 프라이머 이합체의 형성 없이 실온에서 PCR 반응의 조립을 허용합니다. 핫 스타트 PCR의 또 다른 장점은 열 활성화가 없는 반응 순환 조건을 음성 대조군으로 사용할 수 있다는 것입니다.

멀티플렉싱은 각 매개변수에 대해 개별 테스트를 수행하는 것과 달리 단일 테스트에서 다양한 조건이나 요인을 감지하는 기능입니다.1 이는 처리량에 도움이 되고 테스트 비용을 낮추며 환자 치료 효율성을 향상시킵니다.

멀티플렉싱은 종종 프라이머 디자인으로 인해 어려움을 겪습니다. 멀티플렉스 PCR용 프라이머는 균일한 길이의 앰플리콘을 생성하는 일관된 용융 온도를 통해 표적 서열분석에 대해 높은 선택성을 가져야 합니다. 이를 위해서는 프라이머를 디자인할 때 신중한 계산이 필요합니다. 부적절하게 설계되면 프라이머는 동종이량체 또는 이종이량체를 형성하거나 표적 외 서열을 증폭시킵니다.